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全基因组甲基化测序

更新时间:2014-07-07 11:50:51点击次数:4463次字号:T|T

一、 全基因组甲基化测序概述

DNA甲基化是表观遗传调控的常见机制。启动子区域的高度甲基化可导致基因表达改变。甲基化多发生于胞嘧啶(cytosine, C)位置。在细胞和组织分化、疾病发生以及适应环境等过程中,甲基化状态可发生改变。高精确度全基因组甲基化修饰状态的分析,将为发育、育种、肿瘤标志物鉴定或药物靶标寻找等研究奠定基础。

全基因组甲基化测序结合了亚硫酸氢盐转化(bisulfite conversion)方法与新一代高通量测序技术,可在单碱基分辨率水平上高效地检测全基因组DNA甲基化状态。亚硫酸氢盐处理可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变,PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶。对 PCR产物进行高通量测序,与参考序列比对,即可判断CpG/CHG/CHH位点是否发生甲基化。


二、 全基因组甲基化测序技术优势

高分辨率:单碱基分辨率。精确分析每一个C碱基的甲基化状态,是DNA甲基化检测的金标准;
效率较高:亚硫酸氢盐转化结合新一代高通量测序技术,彻底检测基因组所有C碱基,获取全面信息;
应用范围广:适用于所有具有参考基因组的物种,适于进行开创性工作。


三、 全基因组甲基化测序研究内容

全基因组甲基化图谱(DNA methylation profiling)及单样品高低甲基化位点在基因组不同区域的分布:全基因组甲基化测序可全面、精确地检测全基因组DNA甲基化状态,为更深入的表观遗传调控分析奠定基础。在全基因组甲基化图谱的基础上,对基因组不同染色体、不同基因区域、不同序列环境、不同基因功能元件如启动子、外显子、内含子、UTR区的胞嘧啶甲基化状态进行分析,有助于从多个角度研究基因的功能及调控。

研究流程示例


多样品间的差异性甲基化区域(DMR)分析:全基因组甲基化测序不但可使研究者在基因组规模洞察不同生物之间在DNA 甲基化水平和模式上的差异, 也可用于研究同一物种多个样品间的差异性甲基化区域(differentially methylated regions DMRs)。基因组的甲基化状态具有一定的时空特异性。对某一物种,不同的环境、不同的发育阶段、不同类型的样品(细胞、组织、个体)所反映的甲基化状态可能是不同的,存在着差异性甲基化区域。其中有些是与基因调控有关的功区域。鉴定、分析这些区域及其所在的基因或CpG岛,对发育和肿瘤等生命过程研究有一定意义。

研究流程示例



四、 全基因组甲基化测序实验技术路线


全基因组甲基化测序实验流程



五、 全基因组甲基化测序样品要求(基因组DNA)
样品纯度:OD 260/280值应在1.8~2.0 之间; RNA 应去除干净;
样品浓度:最低浓度不低于50ng/?l;
样品总量:每个样品总量不少于15?g;
样品溶剂:应溶解在H20或TE (pH 8.0)中;
样品运输:DNA低温运输(-20℃);在运输过程中用parafilm将管口密封好,以防出现污染。



六、数据分析流程




七、数据分析内容

对亚硫酸氢盐甲基化测序数据进行分析,包括数据预处理、转化效率和测序准确性评估、基因组比对、比对结果相关统计、对于CpG岛区域,启动子区域及整个基因组的覆盖和深度、CpG/CHG/CHH位点甲基化比例计算、 单样本高低甲基化位点在基因组不同功能区域和CpG岛区域的分布、多样本差异甲基化CpG/CHG/CHH位点和差异甲基化区段(DMR)筛选、差异甲基化位点和区段在CpG岛和CpG岛岸的分布统计、差异甲基化位点和区段在启动子和不同基因功能区的统计、相关注释和富集分析(基因、CpG岛、GO和KEGG等)。


1. 测序数据质量控制
包括:总reads数、总base数,Q20比例、Q20位点分布图、碱基分布图。
2. 测序数据预处理
包括:去除总体质量偏低的reads,将质量大于20碱基所占比例小于50%的reads去除;去除3’端质量Q低于20的碱基;去除reads中所含有的接头序列;去除长度小于20的测序片段(reads)。
3. 转化效率评估
使用lamda噬菌体基因组作为内参,评价BS转化效率。



4. 全基因组比对和mapping率统计

5. CpG岛区域、启动子区域及整个基因组的覆盖及不同深度关系

6. CpG/CHG/CHH位点覆盖率、测序深度、甲基化比例和染色体分布

1) CpG/CHG/CHH位点测序深度


2) CpG/CHG/CHH位点甲基化比例

3) CpG/CHG/CHH位点染色体分布

4) 高甲基化位点(甲基化比例>70%)和低甲基化位点(甲基化比例<30%)的基因功能区分布。
5) 甲基化程度(%)对于基因的不同功能区域的分布。


7. 差异甲基化位点和区段筛选
使用fisher检验筛选差异甲基化CpG/CHG/CHH位点和甲基化区段。


8. 差异甲基化位点或区段的CpG岛注释和基因注释
1) 差异甲基化位点或区段CpG岛分布


2) 差异甲基化位点或区段不同基因功能元件分布

3) 差异甲基化位点或区段染色体分布


9. 全基因组甲基化图谱

全基因组甲基化图谱:
















(编辑:sgwwj)
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