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染色质免疫沉淀-测序(ChIP-Seq)

更新时间:2014-07-07 14:17:13点击次数:3618次字号:T|T

一、 染色质免疫共沉淀测序概述

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具,通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与新一代测序技术相结合的ChIP-Seq技术,能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。

ChIP-Seq首先通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP)特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段,并对其进行纯化与文库构建,然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上,从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。



二、 染色质免疫共沉淀测序技术优势
检测覆盖范围广:全基因组范围内扫描目标区域;
检测分辨率高:更利于精确定位目标区域;
样本需要量低:需要的免疫沉淀后的DNA量可低至5-10ng;
可靠性好:避免了非特异性杂交,背景低;
性价比高:花费较少即可检测全基因组,获取准确丰富的信息。


三、 染色质免疫共沉淀测序研究内容

通过富集peak检测,研究转录因子、RNA 聚合酶或其它蛋白在基因组上结合位点及其相关基因。提取peak区域的序列,寻找结合位点的motif,并对peak 进行基因、CpG 岛、GO和KEGG 等注释和分析。对于多个样品,可进行差异分析;

用于组蛋白修饰的表观遗传学研究。通过不同的特异性抗体检测DNA链的某一位置会出现何种组蛋白修饰,以及组蛋白修饰与基因表达的关系。


研究流程示例 



四、 染色质免疫共沉淀测序实验技术路线



ChIP-Seq实验流程



五、 样品要求(ChIP富集的DNA) 
样品纯度:OD 260/280值应在1.8~2.0 之间。 
样品浓度:最低浓度不低于5ng/ul。 
样品总量:每个样品总量不少于30ng。 
DNA片段大小:长度分布小于500bp,峰在300bp左右。 
样品溶剂:溶解在H20或low TE(pH8.0)中。 

样品运输:低温运输 (-20℃);建议用LoBind 管, parafilm将管口密封好,以免污染。



六、数据分析流程 



七、数据分析内容 

对ChIP-seq测序数据进行分析,包括数据预处理、基因组比对、比对结果相关统计、对于基因组的覆盖和深度、富集peak检测、富集peak在启动子和不同基因功能区的分布统计、富集peak区段Fasta序列提取、motif查找、相关注释和富集分析(基因、CpG岛、GO和KEGG等)。



1. 测序数据质量控制 
包括:总reads数、总base数,Q20比例、Q20位点分布图。 

2. 测序数据预处理 
包括:去除总体质量偏低的reads;去除3’端质量Q值低于20的碱基;去除reads中所含有的接头序列;去除长度小于20的测序片段(reads)。

3. 全基因组mapping率 

4. Peak查找 

应用MACS软件对基因组mapping得到的bam文件进行peak 富集区查找。 
5. Peak长度和染色体分布 
Peak长度分布: 


6. 对Peak进行基因和GO功能注释


7. 提取peaks区域的fasta序列并寻找结合motif
motif功能区示意图: 

8. 客户定制分析
可根据客户的研究需求,协商定制个性化分析内容。 







(编辑:sgwwj)
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